بایگانی دسته: زيست شناسي

نگاهى به مهندسى توليد متابوليت هاى ثانويه

تركيبات همه كاره


كسرى اصفهانى


بعضى از موجودات زنده خصوصاً گياهان، طيف وسيعى از تركيبات موسوم به متابوليت هاى ثانويه را توليد مى كنند. در مفهوم كلى، متابوليت هاى ثانويه تركيباتى آلى هستند كه نقش ضرورى در رشد و نمو موجود زنده ندارند. گياهان براى بيوسنتز اين مواد انرژى زيادى را به كار مى برند. زمانى كه اين تركيبات اثرى بر رشد و تمايز گياه نداشته باشند، قاعدتاً بايد منافع ديگرى داشته باشند. مطالعه در زمينه وظايف اين تركيبات در گياهان، يك موضوع جذاب و مهم براى بسيارى از پروژه هاى تحقيقاتى شده است و نقش اكولوژيكى تعدادى از اين تركيبات مورد بررسى و تحقيق قرار گرفته است. با مطالعاتى كه تاكنون صورت گرفته است، به نظر مى رسد كه متابوليت هاى ثانويه، به عنوان موادى طبيعى، نقش اكولوژيكى مهمى در واكنش هاى دفاعى گياهان و همچنين گرده افشانى و انتشار دانه هاى گياهان به وسيله حشرات و حيوانات دارند. بعضى از اين تركيبات به عنوان علف كش و حشره كش در صنعت استفاده مى شوند در حالى كه برخى ديگر كاربرد صنعتى ندارند. دسته بزرگى از متابوليت هاى ثانويه كاربرد دارويى و پزشكى دارند. تركيبات ديگرى از اين گروه نيز نقش مهمى در تغذيه انسان و دام دارند.
• تفاوت هاى متابوليت هاى ثانويه با متابوليت هاى اوليه
سلول ها خصوصاً سلول هاى گياهى دو دسته از تركيبات را توليد مى كنند؛ متابوليت هاى اوليه و متابوليت هاى ثانويه.
• متابوليت هاى اوليه
متابوليت هاى اوليه مستقيماً در رشد و متابوليسم درگير هستند و شامل كربوهيدرات ها، ليپيدها، پروتئين ها و اسيدهاى نوكلئيك مى شوند. در گياهان متابوليت هاى اوليه طى فرايند فتوسنتز توليد شده و سپس در ساخت تركيبات سلول نقش آفرينى مى كنند. اين تركيبات در حجم زياد و با ارزش اقتصادى پائين توليد مى شوند و عمدتاً به عنوان ماده خام صنعت، موادغذايى و افزودنى ها كاربرد دارند. روغن هاى گياهى، اسيدهاى چرب (براى ساخت صابون و شوينده ها) و كربوهيدرات هايى مانند ساكاروز، نشاسته، پكتين و سلولز مثال هايى از متابوليت هاى اوليه هستند. قيمت اين قبيل تركيبات به طور ميانگين دو دلار در هر كيلو بوده و توليد آنها در حجم انبوه امكان پذير است. البته برخى از متابوليت هاى اوليه مانند ميواينوزيتول و بتاكاروتن گران هستند كه علت قيمت بالاى آنها، سختى استخراج و تخليص آنها است.
• متابوليت هاى ثانويه
متابوليت هاى ثانويه از بيوسنتز متابوليت هاى اوليه به دست مى آيند و به عنوان تركيبات فرعى و انتهايى متابوليسم اوليه در نظر گرفته مى شوند. همچنين اين تركيبات در فرآيندهاى متابوليسمى وارد نمى شوند. مهمترين متابوليت هاى ثانويه آلكالوئيدها، فنوليك ها، روغن هاى ضرورى، استروئيدها، ليگنين ها، تانن ها و فلاوونوئيدها هستند. متابوليت هاى ثانويه عمدتاً در گونه ها و خانواده هاى خاصى از سلسله گياهان توليد مى شوند. اين تركيبات به مقدار كمى در سلول ذخيره شده و عمدتاً در سلول هاى تخصصى و در مرحله خاصى از چرخه زندگى گياه توليد مى شوند و همين امر استخراج و تخليص آنها را در مقايسه با متابوليت هاى اوليه كه در تمام سلول ها توليد مى شوند، دشوار مى كند. گياهان دارويى از لحاظ ميزان متابوليت هاى ثانويه بسيار غنى هستند و تركيبات آنها را در انگليسى Medicinal يا Officinal مى نامند. اين تركيبات كه از گروه متابوليت هاى ثانويه هستند، اثرات فيزيولوژيكى عميقى بر پستانداران دارند و از مهمترين تركيبات دارويى هستند. از اين گياهان و اثرات فيزيولوژيك تركيبات موثره آنها به عنوان داروى خوراكى استفاده شده و در نتيجه اين تركيبات، داروهاى گياهى يا داروهاى طبيعى نام گرفته اند. استفاده از داروهاى با منشاء گياهى بدون انجام فرآورى خاصى، يعنى استفاده از پودر گياه يا مواد موثره آن بدون خالص سازى عصاره گياهى، از قديم رواج داشته و حتى در حال حاضر و در پزشكى مدرن از طيف وسيعى از داروهاى با منشاء گياهى استفاده مى شود. گرچه تعدادى از اين داروها به طور مصنوعى براى مصارف ساخته مى شوند ولى هنوز بسيارى از آنها از منابع طبيعى به دست مى آيند. به محض اينكه اثر فيزيولوژيك يك گياه دارويى خاص كشف شود، تلاش ها براى يافتن خصوصيات دقيق شيميايى ماده موثره آن (داروى گياهى) و در پى آن، يافتن روش توليد شيميايى اين تركيبات به طور تجارتى صورت مى گيرد. براى تعيين خصوصيات شيميايى و شناسايى يك متابوليت ثانويه، جداسازى آن به صورت كاملاً خالص الزامى و اولين قدم است. روش هاى جداسازى گوناگون و مراحل آن اكثراً طولانى است. متابوليت هاى ثانويه به صورت خالص و با نسبت هاى مشخص در پزشكى استفاده مى شوند. البته در كنار خالص سازى مواد موثره گياهان دارويى، آنها بدون تغيير نيز در سامانه هاى مختلف تهيه دارو استفاده مى شوند. اين نكته را نبايد فراموش كرد كه در كنار متابوليت هاى ثانويه، تعدادى از متابوليت هاى اوليه نيز اثرات فيزيولوژيكى قوى دارند. اكثر اين تركيبات پروتئينى بوده و عملكردهاى مختلفى دارند. هورمون ها و زهرمارها مثال هايى از پروتئين هاى با اثرات فيزيولوژيكى قوى هستند. آنتى بيوتيك ها، واكسن ها و تعدادى از پلى ساكاريدها كه نقش هورمونى دارند، از جمله متابوليت هاى اوليه با اثر فيزيولوژيكى قابل ملاحظه هستند.
• مسيرهاى توليد متابوليت هاى ثانويه
اسكلت كربنى متابوليت هاى ثانويه از كربوهيدرات ها تامين شده و طى فرآيند فتوسنتز ايجاد مى شود. متابوليت هاى اوليه ديگرى كه در توليد متابوليت هاى ثانويه نقش دارند، اسيدهاى آمينه هستند. استيل كوآنزيم و اسيد مِوالونيك نيز نقش مهمى در توليد انواع ترپنوئيدها دارند. مسير اسيد شيكيميك نيز در توليد ليگنين ها و ايندول آلكالوئيدها نقش آفرينى مى كند.
• مهندسى توليد متابوليت هاى ثانويه در گياهان
در حال حاضر دستاوردهاى زياد و گوناگونى در مهندسى متابوليك متابوليت هاى ثانويه به دست آمده است. مسيرهاى بيوشيميايى مختلفى با استفاده از ژن هاى رمزكننده آنزيم هاى مهندسى شده و پروتئين هاى تنظيمى بررسى شده اند. در عين حال از ژن هاى آنتى سنس نيز براى مسدود كردن مسيرهاى بيوشيميايى و افزايش توليد متابوليت ثانويه خاصى استفاده مى شود. متابوليت هاى ثانويه وظايف مختلفى در طول چرخه زندگى گياه دارند. از جمله اين وظايف انجام نقش تركيبات واسطه در برهم كنش گياه و محيط اطرافش و برهم كنش گياه با حشرات، ريزسازواره ها و حتى گياهان اطراف است. توليد متابوليت هاى ثانويه همچنين ممكن است بخشى از سامانه دفاعى گياه باشد. اين تركيبات در توليدمثل گياه نيز نقش دارند كه از طريق جذب حشرات گرده افشان اين كار را انجام مى دهند. متابوليت هاى ثانويه گياهى نقش مهمى در ايجاد كيفيت مواد غذايى (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند. همچنين رنگ گياهان زينتى و گلبرگ گل ها كه مهمترين خاصيت اين دسته از گياهان است، توسط متابوليت هاى ثانويه ايجاد مى شود. بسيارى از متابوليت هاى ثانويه نيز براى توليد دارو، رنگ، حشره كش ها، طعم دهنده هاى غذايى و عطر استفاده مى شوند. به دليل كاربردهاى فراوان، متابوليت هاى ثانويه موضوع جالبى براى تحقيقات اصلاح نباتات از طريق فنون مولكولى و مهندسى ژنتيك محسوب مى شوند. در ده سال گذشته تحقيقات چندانى در ارتباط با متابوليت هاى ثانويه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام اين تحقيقات اطلاعات اندك از مسيرهاى توليد زيستى متابوليت هاى ثانويه و برهم كنش آنزيم هاى درگير در اين مسير است. همچنين تعداد معدودى از ژن هاى مربوط به متابوليت هاى ثانويه در دسترس است. يكى از مسيرهايى كه مطالعات بيشترى در سطح ژن هاى دست اندركار آن نسبت به ديگر متابوليت هاى ثانويه انجام شده است، مسير توليد فلاوونوئيدها و آنتوسيانين ها است. اكثر ژن هاى درگير در مسير توليد آنتوسيانين ها همسانه سازى شده و مطالعات فراوانى در سطح بيوشيميايى، مولكولى و ژنتيك اين دست از متابوليت هاى ثانويه صورت گرفته است. يكى از مهمترين دلايل مطالعات بيشتر در اين زمينه، آسانى بررسى اين مواد از روى رنگ گل ها به فنوتيپ قابل غربال گرى است. ديگر مسير توليد متابوليت هاى ثانويه كه در سطح آنزيم هاى درگير و مواد واسط مورد مطالعه قرار گرفته است و اهميت زيادى در داروسازى دارند، ايندول آلكالوئيدها هستند. اما در اين مسير هم ژن هاى محدودى مشخص شده اند. هدف از مهندسى ژنتيك مسير يك متابوليت ثانويه، افزايش مقدار يك ماده خاص يا گروهى از تركيبات و يا حتى كاهش مقدار اين تركيبات است. براى دستيابى به هدف دوم كه كاهش ميزان توليد يك ماده خاص يا گروهى از مواد ناخواسته است، راه هاى مختلفى وجود دارد. [اين مواد ممكن است تركيبات سمى در يك محصول گياهى، مواد مانع خالص سازى يك فرآورده صنعتى يا موادى از اين دست باشد.] يكى از اين راه ها، مسدود كردن يك مرحله از مسير توليد متابوليت ثانويه و مختل كردن توليد يا فعاليت آنزيم مربوط به آن مرحله است. اين هدف مى تواند با كاهش ميزان mRNA مسئول توليد اين آنزيم، با استفاده از فناورى آنتى سنس، RNAi يا بيان بالاى يك آنتى بادى عليه آنزيم مسئول محقق شود. فناورى آنتى سنس به خوبى براى تغيير رنگ گل ها استفاده شده است. راه هاى ديگر دستيابى به اين هدف، تغيير مسير به سوى مسيرهاى موازى يا افزايش كاتابوليسم ماده نهايى است. اما ممكن است هدف از انجام تحقيقات، افزايش توليد يك تركيب خاص در گياه بوده يا انتقال ژن هاى مربوط به مسير توليد يك متابوليت ثانويه به يك گياه يا يك ريزسازواره مورد نظر باشد. همچنين ممكن است توليد يك ماده جديد كه به صورت طبيعى در گياهان توليد نشود هدف يك پروژه توليدى- پژوهشى باشد. در برخى روش ها با تغيير ميزان بيان يك يا چند ژن، بر موانع توليد يك ماده غلبه مى كنند و در روش هاى ديگر، با حذف مسيرهاى موازى (رقابتى) يا كاهش كاتابوليسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گياه مى افزايند. ايجاد تغييراتى در بيان ژن هاى تنظيمى كه كنترل مسير توليد زيستى متابوليت هاى ثانويه را برعهده دارند نيز از جمله روش هاى افزايش يا كاهش توليد تركيب مورد نظر است. در ادامه اين مطلب برخى از نتايج به دست آمده از بررسى نحوه توليد متابوليت هاى ثانويه ژن هاى مسئول و تنظيم بيان ژن هاى درگير ارائه مى شود.
• فلاوونوئيد ها و آنتوسيانين ها
ـ ژن هاى مسئول بيوسنتز فلاوونوئيد ها و آنتوسيانين ها
بيوسنتز فلاوونوئيد و آنتوسيانين از اولين مسير هاى متابوليت هاى ثانويه بود كه مهندسى ژنتيك آنها صورت گرفت. دليل اين موضوع اين بود كه مسير بيوسنتز آنها به خوبى شناخته شده بود و نتايج تغييرات انجام شده به راحتى از روى تغيير رنگ گل ها قابل مشاهده است.
آزمايش هاى زيادى شامل افزايش بيان ژن هاى مختلف براى ايجاد رنگ هاى جديد گل يا توليد تركيبات جديد در گياه انجام شده است.
به خاطر خواص آنتى اكسيدانى اين تركيبات افزايش ميزان توليد و مقدار آنها در غذا هاى گياهى موضوع جالب توجهى براى دانشمندان بوده است. اكثر پژوهش هاى انجام شده در زمينه بيوسنتز فلاوونوئيد ها و آنتوسيانين ها در گياه گوجه فرنگى صورت گرفته است. مشخص شده است كه آنزيمى از گروه آيزومراز به نام CHI از آنزيم هاى مراحل اوليه مسير توليد فلاوونوئيد نقشى كليدى در افزايش توليد فلاوونول دارد. افزايش بيان ژن CHI گياه اطلسى باعث افزايش سطح فلاوونوئيد در پوست گوجه فرنگى به ميزان ۷۸ برابر مى شود همچنين با توليد گياهان گوجه فرنگى اصلاح ژنتيكى شده، ميزان فلاوونوئيد آنها بيش از ۲۰ برابر گياهان شاهد بوده است. اين موضوع حاكى از آن است كه افزايش توليد تركيبات مفيد براى سلامتى در محصولات حاصل از گوجه فرنگى امكان پذير است.
بيوسنتز ايزوفلاوون ها كه تركيباتى ضدميكروبى هستند، بر اثر آلودگى ميكروبى در حبوبات القا مى شود. افزايش بيان ژن ايزوفلاوون سنتتاز كه يك آنزيم سيتوكروم P450 است، باعث توليد اين تركيبات در آرابيداپسيس، توتون و ذرت كه به طور عادى توانايى توليد اين مواد را ندارند، مى شود. توليد اين تركيبات در اين گياهان بستگى به در دسترس بودن پيش ماده هاى مسير فنيل پروپانوئيد دارد. القا يا مهندسى اين مسير مى تواند در اصلاح و بهبود سامانه بيوسنتز ايزوفلاوون در گياهان ميزبان مهم باشد.
ـ ژن هاى تنظيم كننده، توليد فلاوونوئيد ها و آنتوسيانين ها
يك روش براى مهندسى بيان ژن هاى يك مسير بيوشيميايى استفاده از عوامل رونويسى خاصى است كه ژن هاى مسير هاى بيوشيميايى متعددى را كنترل مى كنند. در دانه ذرت توليد آنتوسيانين توسط تركيبى از دو عامل رونويسى R و Cl تنظيم مى شود. پروتئين هاى R شباهت زيادى با پروتئين هايى كه توسط ژن هاى مهره داران رمز مى شود (ژن c-MYC) دارد در حالى كه پروتئين هاى Cl مشابه محصولات ژن هاى c-MYB است. القاى مسير توليد فلاوونوئيد با افزايش بيان اين دو عامل رونويسى R و C1 در سلول هاى تمايز نيافته ذرت در محيط كشت صورت مى گيرد. در برنج افزايش بيان اين دو عامل رونويسى مربوط به گياه ذرت در كنار يك ژن ديگر باعث فعال شدن مسير بيوسنتز آنتوسيانين و همچنين افزايش مقاومت گياه برنج به قارچ ها مى شود. در آرابيداپسيس، يك عامل رونويسى از نوع MYB به نام PAP1 تشخيص داده شده است كه افزايش بيان آن باعث توليد رنگدانه هاى بنفش پررنگ در زمان نمو گياه مى شود. اين مثال ها نشان مى دهد كه مى توان با افزايش بيان يك يا چند عامل رونويسى (حتى با استفاده از ژن هاى بيگانه در گياه ميزبان)، بر اين سامانه قدرتمند تنظيمى ژنتيكى در هنگام نمو گياه، غلبه كرد. عوامل رونويسى گاهى به عنوان مانع ذخيره سازى تركيبات طبيعى نيز عمل مى كند. غيرفعال سازى ژن عامل رونويسى MYB4 در آرابيداپسيس مى تواند باعث افزايش سطح موادى شود كه تحمل گياه را نسبت به تشعشعات اشعه ماوراءبنفش مى افزايند. افزايش بيان ژن هاى توليدكننده پروتئين FaMYB1 كه از دسته پروتئين هاى MYB است و از گياه توت فرنگى به توتون منتقل شده است، باعث كاهش توليد رنگدانه هاى گل شده و سطح آنتوسيانين و فلاوونول در گياه توتون پايين مى آيد. تحليل اين اتفاق اينگونه است كه FaMYB1 در ميوه توت فرنگى به عنوان يك مانع در برخى از مراحل مسير توليد فلاوونوئيد عمل مى كند.
• آلكالوئيدها
ـ ژن هاى بيوسنتز ايندول آلكالوئيدها
مسير ترپنوئيد ايندول آلكالوئيد موضوع بسيارى از تحقيقات مهندسى ژنتيك بوده است چرا كه حدود ۱۵ نوع از تركيبات اين مسير از نظر صنعتى اهميت دارند كه آلكالوئيد ضدتومور وينبلاستين از آن جمله است.
همه اين آلكالوئيدها در يك قسمت از مسير بيوشيميايى تا توليد ماده واسط استريكتوزيدين مشترك هستند و از اين نقطه، مسير در گونه هاى مختلف گياهى توليدكننده مواد آلكالوئيدى منشعب مى شود.
بيشتر مطالعات انجام شده براى تهيه نقشه ژنتيكى بخش اوليه و مشترك مسير و افزودن ميزان بيان ژن هاى اين بخش از مسير بوده است. هدف از اين كارها افزايش فعاليت مسير توليد آلكالوئيدها است. به طور مثال، ژن هاى رمزكننده تريپتوفان دِكربوكسيدلاز (TDC) و STR-SS در سلول هاى گياه Catharnthus roseus به خوبى مورد مطالعه قرار گرفته است. افزايش بيان TDC باعث افزايش ماده حدواسط تريپتامين شده در حالى كه به افزايش سطح آلكالوئيدها نمى انجامد اما با حضور STR، افزايش ميزان آلكالوئيدها قابل ملاحظه است. با افزودن ماده حدواسط تريپتوفان و ترپنوئيدها به محيط غذايى لاين هاى سلولى مورد آزمايش، آنها ظرفيت توليد ميزان بالايى از آلكالوئيدها را تا حدود يك ميلى مول در ليتر بروز دادند. اين موضوع به اين معنى است كه شاخه ترپنوئيدى مسير بيوسنتز متوقف شده است. مطالعات تكميلى نشان مى دهد كه مراحل محدودكننده ديگرى نيز وجود دارند كه در اينجا از ذكر آنها خوددارى مى كنيم. TDC و STR در گياهان ديگرى كه مواد آلكالوئيدى توليد نمى كنند نيز بيان مى شود. تغذيه كشت سلولى سلول هاى گياه توتون با سِكولوگانين، باعث توليد استريكتوزيدين شده اما اين ماده كه يك گلوكو آلكالوئيد است، به جاى ذخيره در واكوئل براى توليد ايندول آلكالوئيد در مراحل بعدى (همانند آنچه در Catharnthus roseus اتفاق مى افتد)، به محيط كشت ترشح مى شود. اين موضوع اهميت جنبه هاى فيزيولوژيكى را در توليد زيستى متابوليت هاى ثانويه نشان مى دهد به طورى كه نه تنها ژن هاى رمزكننده آنزيم هاى درگير كاتاليز مراحل توليد زيستى در اين امر مشاركت دارند بلكه ژن هاى ديگرى نيز از جمله ژن هاى تنظيم pH و ژن هاى مربوط به انتقال مواد نيز يك پاى قضيه هستند.
ـ ژن هاى تنظيم كننده توليد ايندول آلكالوئيد
دو عامل رونويسى به نام هاى ORCA2 و ORCA3 كه در چندين مرحله از مسير بيوشيميايى توليد آلكالوئيد در Catharnthus roseus نقش تنظيمى دارند، تعيين شده اند.
افزايش بيان ORCA3 به تنهايى باعث افزايش توليد آلكالوئيدها نمى شود چرا كه اين عامل رونويسى، ژن G10H را كه يك آنزيم سيتوكروم P450 موثر در كاتاليز مرحله اول توليد سكولوگانين است، تنظيم نمى كند. اما پس از تغذيه سلول ها با پيش ماده سكولوگانين كه همان لوگانين است، توليد آلكالوئيدها تا ميزان ۳ برابر افزايش مى يابد. هر دو اين عوامل تنظيمى (ORCA2 و ORCA3) درگير توليد زيستى ترپنوئيد ايندول آلكالوئيد بوده گرچه كنترلى بر ژن G10H ندارند. اين موضوع نشان مى دهد كه ژن هاى ديگرى نيز درگير تنظيم فعاليت اين مسير هستند كه مى تواند موضوع پژوهش هاى بعدى در اين زمينه باشد.
نتايج تمامى اين مطالعات يك پيام مهم را نيز داشت، براى افزايش بيان يك دسته از آنزيم هاى درگير در يك مسير بيوشيميايى مى توان از ژن هاى تنظيمى استفاده كرد به جاى آنكه بيان هر يك از ژن ها را به طور جداگانه افزايش داد.

ادامه خواندن نگاهى به مهندسى توليد متابوليت هاى ثانويه
Share